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求大神帮助，关于我的过表达载体用pEGFPN1质粒构建转染细胞的问题

1.据我了解的，目的蛋白融合了GFP不会使得其功能改变吧，它只是一个绿色荧光蛋白，你要是有这方面担忧的话，病毒构建包被之前就可以选择不带荧光的病毒质粒，对照组也不带。2.转染效率的摸索一个是通过GFP，可以比较直观的证明基因转入细胞，有相关的荧光图片，其实另一个也可以通过PCR、WB等这些间接证实基因转入细胞。最关键的，转染效率要结合病毒本身+细胞类型+细胞状态+操作等综合决定的，有些原代细胞本身就不好被转染，一转染死亡率很高，有些细胞需要耗费大量病毒才能转进去。

aichimaodeyu100 2016-07-07

蛋白和GFP之间加个2A，它们的功能不影响

jassom 2016-07-05

那请问楼上二位，如果我是融合gfp蛋白，在做wb的时候，是不是我的蛋白分子量要加上gfp蛋白的分子量，在切胶的时候位置要比原来目的蛋白的位置要偏大点儿？

jasonreak 2016-07-02

目的蛋白基因+2A+GFP基因这个序列插入你的载体，把载体用lipo转进细胞，它会表达2种蛋白，1是你的目的蛋白，2是GFP蛋白，二者是分开的。跑WB你只需目的蛋白条带

jassom 2016-07-07

jassom 目的蛋白基因+2A+GFP基因这个序列插入你的载体，把载体用lipo转进细胞，它会表达2种蛋白，1是你的目的蛋白，2是GFP蛋白，二者是分开的。跑WB你只需目的蛋白条带加两个A，是指丙氨酸？这就能两个蛋白质分开了？需要添加IRES序列才能分开成两个蛋白质吧

shinian 2016-07-02

是分开的。建议楼主多看看文献

jassom 2016-06-29

楼主你做好了吗，请问楼主用的是什么试剂呀，这个【汉恒无缝克隆试剂盒】好用吗我准备用一下，不知道好不好用